Los principios generales de las reacciones químicas se aplican también a las reacciones enzimáticas. Por este motivo, antes de empezar con la cinética química, se van a repasar algunos conceptos básicos de cinética química.

A continuación, se describirán los siguientes conceptos:

• Cinética enzimática
• Modelo cinético de Michaelis-Menten
• Cálculo de la K_M y la V_max de un enzima
• Actividad enzimática

En una reacción de orden cero, la velocidad de formación del producto es independiente de la concentración de sustrato: v = k

En una reacción de primer orden la velocidad de formación de los productos es directamente proporcional a la concentración del sustrato: v = k [A]. Así, en la reacción:

sacarosa + agua

glucosa + fructosa

La velocidad de hidrólisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentración de sacarosa. Dicho matemáticamente, donde [A] es la concentración de sacarosa a cada tiempo (t) y k es la constante de proporcionalidad. Se dice que ésta es una reacción de primer orden.

Una reacción de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formación del producto depende

• de la concentración de dos sustratos (como en una reacción de condensación): v = k [A₁] [A₂]
• del cuadrado de la concentración de un único sustrato (reacción de dimerización): v = k [A]²

En la tabla siguiente se resumen los distintos tipos de reacción, y la forma de calcular sus parámetros cinéticos.

	ORDEN CERO	PRIMER ORDEN	SEGUNDO ORDEN
Expresión diferencial de la velocidad
Ecuación integrada de la velocidad	[A] = -kt + [A]0	Ln[A] = -kt + Ln[A]0
Vida media (t1/2)
Representación que da lugar a una recta	[A] vs t	Ln[A] vs t	1/[A] vs t
Signo de la pendiente	negativo	negativo	positivo
Significado de la pendiente	-k	-k	k
Significado de la ordenada en el origen	[A]0	Ln[A]0
[A]0 es	b	eb	1/b

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (V_max). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inical del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v₀) y la concentración inicial de sustrato ([S]₀) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

• v₁ = k₁ [E] [S]
• v₂ = k₂ [ES]
• v₃ = k₃ [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [E_T], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[E_T] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v₁= k₁[S] [E_T] - k₁ [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v₁) es igual a la de su disociación (v₂+ v₃):

v₁ = v₂ + v₃

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:

v = v₃ = k₃ [ES] = constante.

Como v₁=v₂+v₃, podemos decir que:

k₁[S] [E_T] - k₁ [S] [ES] = k₂ [ES] + k₃ [ES]

Despejando [ES], queda que: , siendo , en donde la expresión (k₂+k₃)/k₁ se ha sustituído por K_M, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la K_M un parámetro cinético importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [E_T], k₃ y K_M son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

• A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << K_M) v = (k₃ [E_T]/K_M) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, k_obs, de forma que la expresión queda reducida a: v = k_obs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.
• A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k₃ [E_T]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k₃ como [E_T] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (V_max): V_max = k₃ [E_T], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.

Si introducimos el parámetro V_max en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura de la derecha). En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la K_M) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v₀ frente a [S]₀) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La V_max corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la K_M corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la V_max.

Para determinar gráficamente los valores de K_M y V_max es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v₀ frente a 1/[S]₀), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

• La pendiente es K_M/V_max
• La abscisa en el origen (1/v₀ = 0) es -1/K_M
• La ordenada en el origen (1/[S]₀ = 0) es 1/V_max

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de K_M y V_max de un enzima para diversos sustratos.

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 10⁶ µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 10⁶ U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10^-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10^-9 kat).

Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.

La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones:

• K_M es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si K_M = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = V_max/2.
• El valor de K_M da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor K_M, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K_M, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que K_M se define como (k₂+k₃/k₁), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si K_M es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si K_M es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).
• La K_M del sustrato natural es menor que la de los sustratos análogos. Si dos sustratos del mismo enzima tienen distinta K_M, el que presente mayor K_M tiene menor afinidad por el enzima, y la reacción transcurre siempre a menor velocidad que con el sustrato de menor K_M, salvo a concentraciones saturantes de sustrato, donde la v = V_max.
• Los valores de K_M de muchos enzimas son próximos a los de la concentración fisiológica de sus sustratos, de forma que pequeñas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica.