¿Qué se puede aprender de la interacción DNA/proteína con RasMol?

Visión general.

• Esta guía puede tenerse abierta a la vez que el propio programa RasMol, pero es preferible contar con una versión impresa si no estas muy habituado al cambio de aplicaciones en un ordenador.
• Para un baño general sobre estructura de proteínas, es interesante tener el corto, excelente y legible Introduction to Protein Structure (2nd ed.) de Carl Branden y John Tooze, Garland Publishing, 1999
• Si no estás familiarizado con el aspecto de RasMol, conviene que tengas un primer contacto con el programa visitando el RasMol Quick Start en www.umass.edu/microbio/rasmol/rasquick.htm. Tanto allí como en el sitio donde estás leyendo este fichero puedes conseguir lo necesario para seguir este guión: RasMol y el fichero 1d66.pdb que contiene las coordenadas atómicas.
• Este documento consta de dos apartados. En el primero aprendes a aplicar órdenes (comandos) específicos a una molécula específica, 1d66.pdb (complejo proteína Gal4p acomplejada al DNA). En el segundo se proponen instrucciones generales que se pueden aplicar sobre cualquier molécula de tu elección.
• Puedes encontrar otras guías de RasMol en www.umass.edu/microbio/rasmol/softhelp.htm. También tienes el Manual de referencia: respuesta a las preguntas realizadas frecuentemente (FAQ) y otros documentos muy útiles en www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm#rasmanual (todo en inglés).

Convenios

• Las órdenes precedidas de M conviene realizaras utilizando los Menús. Las órdenes que no van precedidas por M deben ser tecleadas en la ventana blanca de comandos.
• Recuerda que RasMol tiene dos ventanas, una negra y otra blanca. En Windows, la blanca comienza minimizada, por lo que tienes que buscarla en la barra de tareas para activarla. En los Macintosh aparece detrás de la negra. En cualquier caso, desplaza hacia abajo la ventana blanca para que puedas ver la última línea de la ventaba blanca por debajo de la negra.
• Las órdenes que aparecen separadas por punto y coma deben escribirse en líneas distintas dentro de la ventana blanca, pulsando la tecla «enter» al final de cada línea.
• Lo que aparece en cursiva son comentarios

Para empezar...

• Arranca RasMol y haz M(enú) File -> Open. Elige 1d66.pdb.
  (Si no vieras el fichero 1d66.pdb, puedes consultar una detallada guía de problemas en www.umass.edu/microbio/chime/prsswc/prssft.htm).
• En cuanto se haga una selección (select), las órdenes posteriores sólo afectarán a los átomos seleccionados. La representación de los átomos no seleccionados no se ve alterada. Una orden de restricción (restrict) es como la orden select pero que además oculta lo que no se selecciona.

Apartado I
Preguntas y respuesta sobre 1d66.pdb

1. ¿Cuántas cadenas aparecen?

   reset ; rotate z 90 ; zoom 150 ; rotate y 40

   Recuerda que debes escribir cada orden separada por «;» en líneas distintas, pulsando «enter» para dar por terminada una línea.
   Con estos comandos colocamos la molécula de manera más adecuada.

   M(enu) Display -> Backbone, M Colours -> Chain

   Ahora cada cadena tiene un color distinto.
   Pincha en cada cadena para obtener su letra identificadora (ID).

2. En el fichero PDB, ¿aparece algo más aparte de las cadenas de DNA y proteína?

   select hetero ; M Display -> Spacefill

   Ahora pueden observarse los oxígenos del agua que quedó retenida en la estructura cristalizada.

   M Colours -> CPK

   CPK es el esquema de colores Corey-Pauling-Koltun.
   Pincha en un átomo para saber a qué elemento corresponde cada color

   restrict not water

   Esto oculta el agua. Princha sobre lo que queda para recordar de qué se trata.
   Ojo con las ambigüedades que tienen los ficheros PDB: CD puede significar «cadmio» así como «carbono delta». El metal que contiene la Gal4p fisiológica es Zn; el Cd es su sustituto en la estructura cristalográfica.

   Para una introducción general a la manera de seleccionar o restringir (ocultar) átomos, residuos, cadenas, ligandos, grupos de residuos (tales como los hidrofóbicos o los cargados) y los átomos más cercanos, ver Select Commands in Chime and RasMol (www.umass.edu/microbio/rasmol/seleccmd.htm aunque esté en inglés).

   Resumen de los arrastres con el ratón
   Acción	Windows	Macintosh
   Rotar X,Y	Pichar Izq	Pinchar
   Trasladar X,Y	Botón der	Comando + Botón
   Rotar Z	Shift + Botón der	Shift + Comando + Botón
   Zoom	Shift + Botón izq	Shift + Botón
   Planos de corte	Control + Boton izq	Control + Botón

3. ¿Dónde están los aminoácidos hidrofóbicos?

   select hydrophobic ; color magenta ; wireframe 0.4

   Observa la anfipatía de las hélices alfa.

   select not water ; M Display -> Spacefill ; M Options -> Slab mode

   Mira en el interior de la molécula para ver con claridad la distribución de los residuos hidrofóbicos e hidrofílicos.
   Mueve el plano de corte con el ratón.

4. ¿Qué es lo que mantiene los iones Cd en su sitio?

   M Options -> Slab mode

   Desactiva al visualización de los cortes de la molécula.

   M Edit -> Select All ; M Display -> Backbone ; M Colours -> Chain
   select cd ; M Display -> Spacefill ; M Colours -> CPK
   select within(2.6, cd)

   Esto selecciona todos los átomos dentro un radio de 2,6 Å respecto a los átomos de Cd.

   M Display -> Spacefill ; M Colours -> CPK

   Pincha para identificar los átomos que lo enmarcan.

5. ¿Cómo se puede guardar este punto de vista (imagen)?
   save script myview1.spt ; M File -> Close

6. ¿Cómo podemos recuperar esta visión más tarde?
   script myview1.spt

7. ¿Dónde están las hélices alfa y las hojas ß?

   M Edit -> Select all ; M Display -> Backbone ; M Colours -> Structure

   Se colorean las hélices en púrpura y las hojas en amarillo (no hay en 1d66.pdb). Cuando en el fichero no aparece la especificación de hélices alfa y hojas ß, el programa realiza su propia determinación.

   structure

   Esto fuerza a RasMol a hacer su porpia determinación de estructuras.

   M Colours -> Structure.

   Fíjate que ahora aparecen los giros en azul.

8. ¿Cómo puedo determinar la distancia entre dos átomos?

   M Display -> Spacefill ; set picking distance

   Ahora pulsa sobre dos átomos y observa la información que aparece en la última línea de la ventana de comandos (la blanca).
   Si quieres marcar los dos átomos con su distancia, prueba lo siguiente:

   set picking monitor

   Ahora pincha sobre dos átomos cerca de los bordes de la molécula ( Con un fondo negro entre los dos átomos se observa mejor).
   Mira lo que pasa si haces:

   color monitor white ; set monitor off ; monitor off

   set picking ident

   Lo anterior restaura las acciones normales cuando se pincha en la imagen para identificar los átomos.
   
   RasMol también puede informar de los águlos planos y ángulos de torsión. Consulta www.umass.edu/microbio/rasmol/distrib/rasman.htm#setpicking

9. ¿Cómo se pueden detectar los contactos entre la proteína y el DNA?

   reset ; M Display -> Backbone;
   color green ; backbone 0 ; rotate z 91 ; translate y -17 ; zoom 200
   select dna ; color white ; spacefill ; center selected
   select dna and backbone ; color yellow

   Ahora puedes ver el DNA con el esqueleto y las bases de distinto color. También está el esqueleto de la proteína como una línea fina verde.

   select within(3.1, dna) and not dna

   Si no pones and not dna, ¡también seleccionarás el DNA! Con la orden anterior se seleccionan 35 átomos.

   dots

   Pulsa ahora la «flecha arriba» hasta que veas aparecer la orden within en la ventana de comandos, pones al final and not water y presionas la tecla «enter» verás que ahora se seleccionan sólo 19 átomos.

   spacefill 0.6

   Los átomos que verdaderamente contactan con el DNA y son de la proteína aparecen como pequeñas esferas amarillas dentro de esferas punteadas. Las esferas punteadas rojas son los átomos de O del agua que mantienen puentes de hidrógeno con el DNA.

   select within(3.1, protein) and dna ; color cpk

   Si haces zoom y pinchas sobre los átomos donante y aceptor puedes identificar el residuo al que pertenecen y evaluar la posibilidad de que un par de átomos estén formando realmente un puente de hidrógeno (o cualquier otro tipo de enlace).

   dots off

   Las esferas punteadas desaparecen de la representación

10. ¿Cómo se puede ver el interior de la molécula?

    Mientras realizas la siguiente secuencia de comandos, no alteres la molécula con acciones del ratón.

    reset ; M Edit -> Select All
    M Display -> Spacefill ; M Colour -> Chain.
    rotate x 83 ; zoom 200
    M Options -> Hetero Atoms (marca el agua)
    select dna ; color cpk
    M Options -> Slab Mode (marca el modo corte)

    La molécula ha sido cortada por la mitad para poder observar la superficie del corte y todo lo que está detrás.

    set slabmode section

    Ahora sólo se muestra la superficie del corte, ocultando todo lo que está delante y detrás de la superficie del corte. Sólo se ven los átomos afectados por el corte de la «cuchilla».

    slab 76

    Ahora puede verse un par de bases GC cortada por el plano de los tres puentes de hidrógeno del tipo Watson-Crick. (Esto no hubiera funcionado si hubieras movido la molécula con el ratón.)

    slab 68

    ¿Qué es esto? Utiliza el ratón para moverte por el plano de corte (pulsa la tecla CTRL y el botón del ratón, y arrastralo por la pantalla)
    ¿Has podido localizar algún par de bases en posición distinta a la prevista por Watson y Crick? (La clave está al final de este documento)

Controlando las representaciones de RasMol

11. ¿Cómo puedo evitar que el DNA rote fuera de la pantalla?

    reset ; restrict dna ; rotate z 90 ; zoom 200

    Prueba a rotar el DNA a lo largo del eje de la doble hebra (mueve el ratón arriba y abajo). Nota que el DNA gira excéntricamente por el eje que pasa por el centro de masas, ya que se tiene en cuenta la proteína invisible

    center selected

    Prueba a hacer lo mismo y observa la diferencia

12. ¿Cómo se pueden obtener múltiples representaciones de los mismos átomos?

    restrict *:d ; M Colours -> CPK

    *:d especifica que sean todos los átomos de la cadena D.

    M Display -> Backbone ; M Display -> Ball & Stick

    Advierte que puedes obtener una representación o la otra, pero no las dos, utilizando el menú Display. Se debe a que la representación del menú Display desactiva cualquier otra representación de los átomos seleccionados. Por el contrario, cuando las representaciones se aplican desde la ventana de comandos, no se desactivan las representaciones anteriores.

    backbone 1.

    Asegurate incluir el punto decimal tras el uno para que RasMol pueda interpretarlo como Angstroms (Å).
    Cuando escribes órdenes de apariencia (display), las representaciones existentes no desaparecen (a diferencia de lo que ocurre con el menú Display).
    «Sticks» es una representación de alambres (wireframe) con un radio distinto a cero. «Balls» son rellenos (spacefill) con un radio uniforme. Presta atencicón a lo que va a pasar ahora con cada orden:

    spacefill off ; wireframe 0.5 ; wireframe 0.1 ; spacefill 0.3 ; backbone 0.1 ; zoom 500

13. ¿Cómo puedo etiquetar un átomo?

    set picking label

    Picha ahora sobre unos poco átomos.

    color labels white ; label off ; set picking ident

    Pincha sobre un átomo y fíjate en su número identificador (ID, 3ª palabra en la línea informativa). Este número lo señalaremos como ### en la orden siguiente.

    select atomno = ### ; label "Mi átomo favorito"

    label off

14. ¿Cómo se puede ver una molécula en estéreo?

    M Options -> Stereo

    Ahora necesitas trasladar la imagen de la izquierda al centro.
    Por defecto se muestra un estéreo superpuesto (cross-eyed). El estéreo separado (wall-eyed) se obtiene tecleando:

    stereo -5

    Ver el estéreo necesita práctica, es molesto para la vista y no es necesario en la mayoría de los casos. Rotación sin estéreo proporciona una percepción excelente de las relaciones 3D principales. Sin embargo, si visualizas habitualmente imágenes moleculares, aprender a verlas en estéreo te permitirá obsevar relaciones espaciales complejas con mayor claridad. Gale Rhodes ha proporcionado una introducción excelente a la visualización en estéreo en www.usm.maine.edu/~rhodes/0Help/StereoView.html

Apartado II
Exploranto moléculas de tu elección

Para comenzar...

• Obtener el fichero PDB de la molécula escogida. Para ello, puedes consultar Molecules Galore en www.umass.edu/microbio/rasmol/whereget.htm
• Mirar dentro del fichero PDB (usando cualquier editor de textos) en busca de referencias a artículos científicos. La lectura de estos artículos es a menudo esencial para comprender lo que se esta viendo. Por ejemplo, ¿qué parte de la molécula real está representada en el fichero PDB? ¿Cómo se preparó?
• Utiliza el menú de RasMol «File -> Open» para mostrar la molécula. Si la molécula no se ve, consulta la guía de errores en www.umass.edu/microbio/chime/prsswc/prssft.htm
• Si una orden no tiene efecto, puede que no tenga ninguna selección sobre la que aplicarse. Por ejemplo, si haces select hetero y luego color structure, no hay proteína seleccionada sobre la que aplicar el esquema de colores de la estructura secundaria, por lo que no ocurrirá nada. Solución: seleccionar todo o seleccionar partes relevantes y volver a reintentarlo.

1. ¿Cuántas cadenas aparecen?

   M Display -> Backbone ; M Colour -> Chain

   En cualquier momento se puede restringir la imagen a una o a parte de las cadenas presentes. Pincha para identificar la letra asignada a cada cadena.
   Suponiendo que quieras ocultar todas las cadenas excepto las B y D:

   restrict :b or :d

   Para volver a mostrar todas las cadenas:

   M Edit -> Select all.

   Si quieres mirar parte de un gran fichero PDB (más de 500,000 bytes), mejorarán las prestaciones de RasMol si editas el fichero PDB y borras todos los átomos excepto los que quieres ver. Para eso, selecciona los deseados atoms/chains/residues/ligands en RasMol, y escribe:

   save pdb filename.pdb

   Luego abre el nuevo fichero PDB en RasMol para seguir trabajando. ¡Asegúrate que no omites ligandos importantes!

2. ¿Aparece algún ligando?

   select hetero ; M Display -> Spacefill ; M Colour -> CPK

   Pincha sobre el ligando para ver su código de 3 letras asignado en el ficheo PDB. Los ligandos se pueden seleccionar con el código de 3 letras.
   A menudo, el fichero PDB contiene anotaciones sobre los ligandos (ábrelo con cualquier editor de texto)
   
   Es frecuente que la molécula esté rodeada de átomos de oxígeno procedentes del agua (recuerda que los hidrógenos no se resuelven en la cristalografía de rayos X). Los cristales de proteínas suelen ser muy húmedos y gelatinosos, las estructuras obtenidas de los cristales coinciden bastante bien con las de la proteína en solución analizada por NMR. La mayoría de las moléculas de agua en el cristal difunden al azar, por lo que quedan difusas o invisibles. Las únicas moléculas de agua que aparecen están firmemente unidas a la biomolécula e inmovilizadas.
   Para ocultar el agua:

   restrict not water.

3. ¿Cuál es la estructura secundaria?

   M Display -> Cartoon ; M Colour -> Structure

   Las hélices alfa aparecen en Rojo-magenta, las hojas ß son amarillas, los giros azules y lo demás blanco. Lo habitual es que el fichero PDB contenga las especificaciones de HELIX o SHEET con cada átomo del aminoácido. En este caso, RasMol obedece las directrices, pero si no aparecieran, el programa es capaz de aplicar sus propios algoritmos. Para forzar su interpretación, basta escribir la orden:

   structure

4. ¿Dónde están los extremos N y C?

   M Colour -> Group

   La presentación en forma de esqueleto (Backbone) es la mejor para analizar esto. Cada cadena comienza en azul y mediante la serie del arcoiris (verde, amarillo, naranja) termina en rojo.
   Si se observa que la mayoría de la(s) cadena(s) están en azul, hay que dejar los átomos «hetero» sin chequear antes de volver a escoger el esquema de colores «group»:

   M Options -> Hetero atoms ; M Colour -> Group.

   Existen una serie de reglas nemotécnicas:

   • Azul = Frío = viejo (Extremo N en proteínas y 5' en ácidos nucleicos)
   • Rojo = Caliente = Nuevo (Extremo C en proteínas y 3' en ácidos nucleicos)
   • La síntesis comienza en el extremo más viejo, y los nuevos residuos se añaden en el extremo más nuevo.
   • El extremo N coincide con el azul del N en el esquema CPK. El extremo C coincide con el rojo del O en el esquema CPK. El extremo 3' de los ácidos nucleicos acaba en el rojo del O del 3'-OH.

5. ¿Dónde están los residuos hidrofóbicos?

   M Edit -> Select All ; M Display -> Spacefill

   select protein ; color [180,180,180]

   select protein and backbone ; color [100,0,100]

   select protein and not (backbone or hydrophobic) ; color magenta

   También puedes hacer:

   select not protein ; color greenblue

   Los requerimientos de puentes de hidrógeno de los átomos del esqueleto suelen satisfacerse con otros átomos del mismo esqueleto. Por eso no es frecuente encontrar puentes de hidrógeno entre átomos que no sean del esqueleto. Los átomos del esqueleto se asignan mediante un color oscuro (magenta), por lo que se indica que son hidrofílicos. Los residuos hidrofóbicos son grises para indicar su alto contenido en C. Los residuos polares o cargados son magenta brillante para indicar su naturaleza extremadamente hidrofílica. El magenta se utiliza para representar una mezcla a partes iguales de rojo y azul (rojo para las cargas O = positivas, y azul para las cargas N = negativas).
   
   Laz zonas extensas de residuos hidrofóbicos en la superficie de proteínas sugieren que estas zonas contactan con algo hidrofóbico en lugar de agua. Por ejemplo, las proteínas que forman multímeros con otras, o proteínas que total o parcialmente están rodeadas o unidas a lípidos.

6. ¿Dónde están los puentes disulfuro?

   M Display -> Wireframe ; ssbonds 0.8

   En la ventana de comando debe aparecer el mensaje indicando el «Number of bridges» que ha detectado. Si el resultado es cero, la molécula no contiene puentes disulfuro.
   En el caso de haber puentes disulfuro, deben verse como barras de 0,8 Å de grosor. Seguramente te ayudará colorearlos con:

   color ssbonds yellow

   Si a pesar de que hay varios puentes disulfuro pero no logras verlos, lo más probable es que no tengas seleccionada la proteína que contiene las Cys involucradas en este puente. Para solucionarlo:

   MEdit -> Select All

   Y ahora vuelve a repetir las dos líneas de órdenes anteriores.

   M Display -> Backbone ; M Colour -> Chain

   Ahora sólo se ven los carbonos alfa. Ningún otro átomo de las Cys se puede observar. Ya que los puentes disulfuro conectan átomos de azufre de las cadenas laterales de Cys que no se muestran, dichos puentes parecen flotar en el espacio. Se puede conseguir que los puentes conecten los carbonos alfa de las Cys escribiendo:

   set ssbonds backbone

   Los puentes disulfuro vuelven a su posición original con:

   set ssbonds

   Los puentes disulfuro se hacen desaparecer con:

   ssbonds off

7. ¿Dónde están los puentes de hidrógeno?

   M Edit -> Select All ; M Display -> Backbone; M Colour -> Structure

   restrict helix ; backbone 0 ; hbonds 0.5 ; color hbonds white

   RasMol muestra sólo los puentes de hidrógeno dentro de un mismo esqueleto. No tiene la capacidad de mostrar los puentes de hidrógeno entre cadenas, entre ligandos y sus sitios de unión, etc.
   Al igual que ocurría con ssbonds, lo puentes de hidrógeno también parecen «flotar en el espacio» ya que los átomos que conectan no se muestran en la visualización del esqueleto (backbone). Los puentes disulfuro pueden esquematizarse como enlaces entre las posiciones del esqueleto escribiendo:

   set hbonds backbone

   Para restablecer la posición de los puentes de hidrógeno, escribe:

   set hbonds

   Para hacer desaparecer los puentes de hidrógeno, escribe:

   hbonds off

   Intenta repetir la secuencia anterior, peso en lugar de teclear restrict helix, sustitúyelo por restrict sheet. Y también intentalo sustituyendo por restrict not (helix or sheet).

8. ¿Dónde están los puentes intercatenarios? ¿Y los enlaces ligando::proteína?

   Como ya se ha explicado al hablar de los puentes de hidrógeno, RasMol sólo es capaz de mostrar los puentes de hidrógeno dentro de una misma cadena. Para encontrar puentes de otro tipo entre radicales, debe utilizarse la orden within de manera similar a como se hizo en el Apartado I de este guión con el fichero 1d66.pdb. Un puente de hidrógeno estándar tiene una longitud máxima de 3,0 Å entre el núcleo de los átomos donante y aceptor (por ejemplo, N y O). Este valor resulta de sumar 1,0 Å de un enlace covalente entre el H que RasMol no muestra y su átomo correspondiente, más los 2,0 Å del puente de hidrógeno entre el H y el átomo con el que comparte la nube electrónica. Por tanto, una distancia de 3,0 Å (o siendo generosos, 3,2 Å) es la adecuada para utilizar con la orden within. Todo átomo que se encuentre en ese radio es susceptible de estar formando un puente de hidrógeno.
   
   Las interacciones hidrofóbicas tienden a ser más largas: hasta 4,0 Å de C a C.
   
   No existe ninguna manera ideal de pintar un puente de hidrógeno arbitrario. La mejor manera es utilizar la orden set picking monitor (consulta la sección anterior sobre «¿Cómo puedo encontrar la distancia entre dos átomos?»). Así se dibuja una línea de puntos entre los átomos, optativamente marcados con la distancia que los separa en Å. La limitación está en que no puedes alterar el grosor de la línea.
   
   Todos estos métodos que utilizan la orden within son muy laboriosos. Así que se ha desarrollado un interfaz automático denominado Noncovalent Bond Finder en www.umass.edu/microbio/chime/find-ncb/index.htm