saltar al contingut principal
Cercar
URV

Seqüenciació automàtica de DNA


Descripció tècnica

Seqüenciar automàticament DNA és determinar la successió precisa de nucleòtids en una mostra de DNA, mitjançant una modificació del mètode descrit per Sanger et al. (J. Mol. Biol. 1975; 94:441-8).

Bàsicament i mitjançant la tecnologia de la reacció en cadena de polimerasa (PCR), la mostra de DNA (fragment de PCR o vector de clonació) és seqüenciada en presència d'una poli- merasa de DNA termoestable i dels quatre dideoxinucleòtids terminadors (ddNTP), cadascun marcat amb un fluorocrom diferent.

Aquests nucleòtids modificats s'incorporen a la nova cadena de DNA en síntesi i en fan aturar l'elongació, la qual queda “marcada” amb el fluorocrom corresponent al ddNTP incorporat.

Com a conseqüència de la reacció de seqüenciació, es generen múltiples fragments de DNA fluorescents, que són separats per mida mitjançant l'electroforesi capil·lar i detectats durant l'e- lectroforesi, gràcies a un sistema de detecció de fluorescència induïda per làser.

Prestacions

  • Les aplicacions d'aquesta tecnologia inclouen la caracterització molecular de gens, el diagnòstic de malalties hereditàries, el triatge (screening) mutacional d'oncogens i gens supressors de tumors, la identificació d'espècies bacterianes, la seqüenciació de DNA fòssil...
  • Quantificació absoluta i relativa de DNA.
  • Discriminació al·lèlica.
  • Assajos de detecció d'absència/presència.
  • Realització de corbes de dissociació a temps final.

Equipament

  • Beckman Coulter CEQ-8000